J Hepatol丨脂肪肝机制研究新突破——PNPLA3(148M)突变通过功能获得机制抑制甘油三酯水解导致脂肪肝

BioArtMED 2024年11月26日 06:31

统计显示代谢相关脂肪性肝病（Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）在我国的发病率已经接近三分之一【1】。阐明脂质在肝脏中的正常代谢和异常积累的机制是理解脂肪性肝病发生和发展的重要机制性问题及临床转化探索的基础。除了肥胖，胰岛素抵抗等因素外，遗传因素对MASLD的发生发展也起着非常重要的作用。PNPLA3（patatin-like phospholipase domain-containing protein 3）高表达于肝脏脂滴上，是参与肝脏脂质代谢的重要分子。其第148位异亮氨酸突变为甲硫氨酸（I148M）是已知与MASLD的发生相关性最强的遗传因素，也是众多药企尝试靶向的重要治疗靶点。然而，关于PNPLA3(148M)如何促进肝脏中脂质积累并引发脂肪性病变的机制并不清楚。目前较为流行的假说有两种，一种认为PNPLA3作为一种甘油三酯水解酶，148M突变会导致酶活性下降，从而减少甘油三酯的水解，即功能缺失（loss-of-function）；另一种假说认为PNPLA3(148M)突变会导致蛋白在脂滴上的积累，从而影响脂滴的正常功能，即功能获得（gain-of-function）。

美国得州大学西南医学中心（UT Southwestern Medical Center）霍华德休斯研究员Helen H. Hobbs院士团队长期致力于研究脂肪肝的发病机制和开发治疗靶点。Hobbs教授因发现PCSK9调节胆固醇的机制获得2016年Breakthrough Prize。2008年，该团队通过 GWAS发现了PNPLA3(148M)与脂肪肝之间的密切关系【2】。近日，该团队在Journal of Hepatology上发表了题为PNPLA3(148M) is a gain-of-function mutation that promotes hepatic steatosis by inhibiting ATGL-mediated triglyceride hydrolysis的文章（助理教授汪洋博士和Helen H. Hobbs院士为共同通讯作者，汪洋博士和洪森博士为共第一作者）。在该文中，研究者们发现PNPLA3可以与肝脏中最重要的甘油三酯水解酶ATGL竞争其激活因子ABHD5，从而抑制肝脏中ATGL介导的脂质水解。正常情况下，PNPLA3的表达随着食物摄取而增高，在饥饿状态下则会快速降解。PNPLA3(148M)突变导致PNPLA3的泛素化降解减少，从而富集在脂滴表面，持续抑制ATGL的活性，导致肝脏中脂质的累积。

汪洋博士之前的工作表明，PNPLA3和ATGL都可以与ABHD5结合【3】。由于这两个蛋白与ABHD5结合强度较弱，它们的相互作用又受到脂滴定位的调控，因此作者使用了NanoBiT的方法来动态测定活细胞中PNPLA3及ATGL与ABHD5结合的能力。结果显示PNPLA3与ABHD5的结合能力的确远强于ATGL与ABHD5（约15倍）。然而，PNPLA3(148M)和ABHD5的结合能力与PNPLA3(WT)相比并没有明显区别。接下来，作者在NanoBiT系统中加入了不含NanoTag的PNPLA3，结果发现无论是PNPLA3(WT)还是PNPLA3(148M)，都可以以剂量依赖的形式降低ATGL 与ABHD5的相互作用，且降低的程度相似。而ATGL则对PNPLA3和ABHD5的相互作用没有显著影响。之前的研究证明PNPLA3(148M)可以通过逃逸泛素化降解积累在脂滴上【4】。因此，上述结果说明PNPLA3(148M)在肝脏中并不是因为与ABHD5的结合能力变强，而是由于蛋白的积累，导致总体结合的ABHD5增多，对ATGL的抑制作用增强，导致脂质堆积。

由于这些蛋白都是脂滴蛋白，因此作者分析了蛋白的脂滴定位对它们相互作用的影响。首先，研究者们构建了无法定位在脂滴上的ABHD5突变体ABHD5-LBD，并与PNPLA3或ATGL在293细胞中共表达。结果发现，当ABHD5-LBD与ATGL共表达时，二者的细胞定位并没有变化：ABHD5-LBD表达于细胞质中，而ATGL分布在脂滴上；当ABHD5-LBD与PNPLA3共表达时，二者同时定位在了脂滴上。这进一步表明PNPLA3与ABHD5的相互作用确实强于ATGL与ABHD5。而当研究者构建了无法定位于脂滴上的PNPLA3突变体PNPLA3-LBD时，他们发现PNPLA3(WT)或(148M)都可以抑制ATGL水解脂滴，而这些突变体 (WT-LBD, 148M-LBD) 对ATGL都没有抑制作用。因此，PNPLA3定位于脂滴是该蛋白抑制脂质水解的重要环节。

接下来，作者在体外利用重组蛋白系统重现了PNPLA3抑制由ABHD5激活的ATGL甘油三酯水解活性的生化过程。结果表明，无论是野生型还是148M突变，PNPLA3都以剂量依赖的形式降低了ABHD5激活后的ATGL脂质水解活性，且降低的程度相似，进一步佐证了之前细胞实验中的结论。此外，该研究再次证明PNPLA3是一种比ATGL水解活性更低的甘油三酯水解酶，并且148M突变降低了PNPLA3水解甘油三酯的活性。作者通过体外实验直接观测到ABHD5能够激活PNPLA3重组蛋白的甘油三酯水解酶活性，这与之前在细胞中的发现相吻合。

为探明PNPLA3(148M)引起的肝脏脂质堆积是否依赖ATGL，作者利用腺病毒在ATGL肝脏特异性敲除小鼠中表达了PNPLA3(WT)和(148M)，检测肝脏中的甘油三酯含量是否会进一步上升。结果显示，在内源性ATGL缺失的情况下，过表达的PNPLA3(WT)可以大幅降低肝脏中的甘油三酯含量，而过表达PNPLA3(148M)则不会影响肝脏中的甘油三酯含量。该结果不仅印证了PNPLA3具有甘油三酯水解酶活性，而且说明 PNPLA3(148M)通过抑制ATGL的活性引起了肝脏中的脂质累积。

最后，为了进一步证实ABHD5是否是PNPLA3(148M)限制脂质水解的关键分子，作者利用AAV 在Pnpla3^M/M敲入小鼠中过表达ABHD5，检测PNPLA3(148M)引起的脂肪肝能否被逆转。结果表明，外源性表达ABHD5显著降低了Pnpla3^M/M小鼠肝脏中的甘油三酯，达到了野生型对照鼠的水平，从而证实脂滴表面可被ATGL利用的ABHD5的减少是PNPLA3(148M)抑制ATGL水解甘油三酯并引起脂肪肝的重要原因。

综上所述，该研究发现脂肪肝致病遗传突变PNPLA3(148M)甘油三酯水解酶活性的降低并不是导致脂质在肝脏中异常累积的主要原因。PNPLA3(148M)通过逃逸泛素化降解使蛋白富集于脂滴上并与ATGL竞争结合ABHD5，从而抑制ATGL对肝脏中甘油三酯的水解，导致肝脏中脂质的过度积累。由于PNPLA3(148M)通过功能获得，而不是功能缺失导致脂肪肝，因此应该采取减少而不是增加PNPLA3的表达来逆转PNPLA3(148M)引起的脂肪肝。这一结论与最新的临床实验结果相吻合：对携带PNPLA3(148M)纯合基因的脂肪肝病人进行siRNA治疗，可以在12周后减少病人肝脏中46%的脂质含量【5】。Hobbs团队的这一研究为针对PNPLA3(148M)开发的siRNA等疗法提供了理论依据。

得州大学西南医学中心的助理教授汪洋博士为本文的共第一作者与共通讯作者，洪森博士为共第一作者，Helen H. Hobbs教授为本文的共通讯作者。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168827824027077?via%3Dihub

制版人：十一

参考文献

[1] Fan JG, Xu XY, Yang RX, et al. Guideline for the Prevention and Treatment of Metabolic Dysfunction-associated Fatty Liver Disease (Version 2024). J Clin Transl Hepatol 2024;12:955-974.

[2] Romeo S, Kozlitina J, Xing C, et al. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet 2008;40:1461-1465.

[3] Wang Y, Kory N, BasuRay S, et al. PNPLA3, CGI-58, and inhibition of hepatic triglyceride hydrolysis in mice. Hepatology 2019;69:2427-2441.

[4] BasuRay S, Smagris E, Cohen JC, et al. The PNPLA3 variant associated with fatty liver disease (I148M) accumulates on lipid droplets by evading ubiquitylation. Hepatology 2017;66:1111-1124.

[5] Fabbrini E, Rady B, Koshkina A, et al. Phase 1 trials of PNPLA3 siRNA in I148M homozygous patients with MAFLD. N Engl J Med 2024;391:475-476.