CRISPR-Cas12a技术因其在多重基因编辑中的独特优势，逐渐成为基因组工程领域的重要工具。然而，Cas12a的大尺寸限制了其在原代细胞中的稳定表达和递送效率。基于此，耶鲁大学陈斯迪课题组开发了一系列Cas12a敲入小鼠模型，这些模型能够在体内和体外实现高效的多重基因编辑。

该研究成果以Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering的论文为题，于2025年3月20日在《Nature Biomedical Engineering》期刊上发表。陈斯迪教授，约翰霍普金斯医学院Matthew Dong（MD PhD）和即将成为威斯塔研究所（The Wistar Institute）独立PI的周小宇博士为该论文的共同通讯作者。耶鲁大学博士学生唐开元和周立群为该论文的共同第一作者。

条件性和组成性Cas12a敲入小鼠的生成

图1展示了条件性和组成性LbCas12a和enAsCas12a敲入小鼠的生成过程。研究人员通过将Cas12a基因插入Rosa26位点，构建了这些小鼠模型。Cas12a的表达由CAG启动子驱动，并通过LoxP-3xPolyA-Stop-LoxP（LSL）盒进行条件性控制。通过Western blot和IVIS成像，研究人员验证了Cas12a在不同器官中的表达情况，结果显示Cas12a在脑、肝和肺中的表达水平较高。此外，血液学分析表明，Cas12a的组成性表达未引起明显的病理变化。

图1：条件性和组成性LbCas12a和enAsCas12a敲入小鼠的生成。

LbCas12a和enAsCas12a小鼠的多重基因编辑能力

图2展示了LbCas12a和enAsCas12a小鼠在多种免疫细胞中进行多重基因编辑的能力。研究人员开发了逆转录病毒递送系统，通过mScarlet荧光蛋白标记转导细胞，并在BMDCs、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞中实现了单基因和双基因敲除。流式细胞术和NGS数据验证了基因编辑的高效性，特别是在BMDCs中，双基因敲除的效率显著高于单基因敲除。

图2：利用LbCas12a和enAsCas12a小鼠进行多重免疫细胞基因编辑。

LNP-crRNA和AAV介导的体内基因编辑

图3展示了利用LNP-crRNA和AAV递送系统在enAsCas12a小鼠中进行的体内基因编辑。通过LNP递送crRNA，研究人员成功在小鼠肝脏中敲除了TTR基因，并通过AAV递送crRNA阵列，诱导了唾液腺鳞状细胞癌和肺腺癌的发生。这些结果表明，Cas12a敲入小鼠模型在体内基因编辑和疾病建模中具有广泛的应用潜力。

图3：通过肝脏LNP-crRNA靶向和AAV介导的肿瘤生成展示体内基因编辑。

enAsCas12a小鼠的高靶向效率和低脱靶效应

图4展示了enAsCas12a小鼠在肿瘤和免疫细胞中的高靶向编辑效率和低脱靶效应。通过全基因组测序和靶向测序，研究人员验证了多个肿瘤抑制基因的高效编辑，并展示了单细胞水平的四重基因敲除。此外，研究人员还通过WGS和靶向测序评估了脱靶效应，结果显示enAsCas12a小鼠在保持高靶向效率的同时，脱靶效应处于可控水平。

图4：enAsCas12a敲入小鼠展示了高靶向效率和低脱靶编辑效率。

同时进行基因激活和敲除的DAKO系统

图5展示了通过将LSL-enAsCas12a-HF1小鼠与dCas9-SPH小鼠杂交，构建的DAKO系统。该系统能够在同一细胞中同时实现基因激活和敲除。研究人员在BMDCs中验证了该系统的有效性，展示了CD24敲除和ITGB4激活的双重调控。这一系统为研究复杂基因调控网络提供了新的工具。

图5：利用LSL-enAsCas12a-HF1;dCas9-SPH双转基因小鼠实现同时的基因激活和敲除（DAKO）。

【结论】

通过生成条件性和组成性Cas12a敲入小鼠模型，研究人员成功展示了Cas12a在多重基因编辑、疾病建模和免疫细胞工程中的广泛应用潜力。这些小鼠模型不仅简化了原代细胞的基因组工程过程，还为研究复杂基因相互作用和开发新型治疗方法提供了强大的工具。未来的研究可以进一步优化Cas12a的表达和递送系统，以拓展其在更多领域的应用。

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原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41551-025-01371-2

来源：BioMed科技
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