L’expression stable de l’aquaporine tonoplastique BobTIP26-l::GFP dans des cellules de tabac cultivées en suspension crée un nouveau phénotype cellulaire

Abstract

La vacuole des cellules vegetales est un organite essentiel pour le maintien de la turgescence cellulaire. Sa membrane, le tonoplaste, contient des canaux a eau appeles aquaporines qui jouent un role important pour l'osmoregulation. Le gene codant l'aquaporine tonoplastique de chou-fleur BobTIP26-1 (Barrieu et al., 1998) a ete fusionne avec le gene codant la GFP (Green Fluorescent Protein). Des cellules de tabac en suspension ont ete transformees de facon stable avec ce gene. La fonction de transport d'eau de l'aquaporine etiquetee par la GFP a ete verifiee dans un systeme heterologue, les ovocytes de Xenope. Ce test fonctionnel consiste a injecter l'ARNc de BobTIP26-1::GFP dans des ovocytes de Xenope et a les placer dans un milieu hypoosmotique trois jours apres l'injection. Les ovocytes exprimant un canal a eau gonflent, ce qui traduit la fonctionnalite du produit du gene. Les resultats montrent que BobTIP26-1::GFP est une proteine fonctionnelle (permeabilite osmotique P f = 0,279 ′ 0,042 cm.s - 1 ), mais le transport d'eau est attenue par rapport a la proteine BobTIP26-1 connue comme un transporteur tres actif (Barrieu et al., 1999) (P f = 1,670 ′ 0,132 cm.s - 1 ; controle negatif H 2 O: P f = 0,110 ′ 0,023 cm.s - 1 ). La presence de la proteine dans la membrane plasmique de l'ovocyte, destination par defaut de l'aquaporine en absence d'une vacuole, a ete verifiee par Western blotting. Une analyse au microscope photonique montre que les cellules exprimant l'aquaporine BobTIP26-1::GFP sont en moyenne deux fois plus grandes que les cellules temoins, donc huit fois plus volumineuses (figure). Ce nouveau phenotype est directement lie a l'expression d'une aquaporine (dont le gene est sous la dependance du promoteur constitutif CaMV35S), ce qui est en accord avec sa fonction physiologique de canal a eau dans un systeme vegetal. Une reconstitution tridimensionnelle de la vacuole a ete effectuee grâce au marquage du tonoplaste par la fluorescence verte de BobTIP26-1::GFP, permettant, pour la premiere fois, de se rendre compte de la complexite dynamique de cette membrane en condition vitale.