Détermination du rôle pro-fibrosant des éosinophiles humains sur l’épithélium respiratoire

Abstract

Introduction

Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) sont des pathologies rares d’étiologies variées menant pour la plupart à la fibrose pulmonaire. Sur une cohorte de 220 atteints de PID fibrosantes suivis à l’hôpital Foch, 58 présentaient un taux de polynucléaires à éosinophiles (PNE) sanguin > 300/mm³ considéré comme élevé [1]. Bien que le rôle des PNE dans le développement et/ou l’exacerbation des PID ait été fortement suggéré [2], il n’a jamais été démontré. Nous émettons l’hypothèse que les PNE jouent un rôle dans la physiopathologie des PID. Afin de la vérifier, le projet INTREPID propose de caractériser les médiateurs de l’immunité de type 2 (cellulaires et solubles) chez 60 patients atteints de PID, en fonction de leur taux de PNE sanguin et de contrôler le caractère pro-fibrosant de leurs PNE in vitro. Les résultats présentés sont issus de la mise au point du modèle in vitro réalisés sur des volontaires sains.

Méthodes

Les PNE ont été isolés du sang de donneurs sains puis mis en culture, après vérification de leur pureté par cytométrie de flux CytoFlex SRT. Leur viabilité a été vérifiée par dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) après 48 h de culture. Les PNE ont été mis en coculture avec des lignées épithéliales bronchiques et alvéolaires (respectivement les cellules BEAS-2B et A549) en interface liquide-liquide et air-liquide. Les cytokines (IL-6, CXCL8, CCL5 et CCL2) ont été dosées par ELISA et une mesure de la résistance transépithéliale (TEER) a été effectuée. Les expectorations induites de sujets sains ont été analysées par cytométrie de flux et par coloration MGG afin d’étudier les différentes sous-populations cellulaires.

Résultats

Les cultures de PNE présentent des caractéristiques satisfaisantes en terme de pureté (> 90 %), absence d’activation des PNE (CD₆₃-), ainsi qu’une viabilité jusqu’à 48 h de culture (pas d’augmentation significative de la LDH). Lors des co-cultures en interface liquide-liquide, il a été observé une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, CXCL8 et CCL2) par l’épithélium respiratoire BEAS-2B et A549 en présence de PNE. Une diminution de la TEER a également été observée en présence de PNE sur les cellules BEAS-2B. L’analyse par cytométrie des expectorations a permis d’identifier les différents types cellulaires tels que les macrophages, les monocytes, les éosinophiles, les neutrophiles, les lymphocytes T et les lymphocytes B.

Conclusion

Cette étude de faisabilité décrit la mise au point de la culture des PNE et de la co-culture avec les lignées de cellules épithéliales respiratoires. Les modèles de coculture nous ont permis d’identifier un effet pro-inflammatoire des PNE au contact des lignées épithéliales bronchiques et alvéolaires. Par la suite ces expérimentations seront réalisées dans le cadre du projet INTREPID sur des PNE issus du sang et des expectorations induites de patients suivis pour une PID à l’hôpital Foch et des cellules primaires bronchiques humaines.