[Can Coronavirus HCoV-229E be Used as a Model Virus Instead of SARS-CoV-2 in Antiviral Efficacy Studies?]

Abstract

Son yıllarda pandemi nedeniyle virüslerin tanı ve tedavisine yönelik terapötik yöntemlerin geliştirilmesi ve antivirallerin test edilmesi amacıyla çok sayıda in vitro çalışma yapılmaktadır. Literatürde SARS-CoV-2'nin modellenebilmesi için HCoV-229E'nin kullanımının güvenli ve yeterli olup olmadığını inceleyen çalışmalar sınırlıdır. Bu sebeple bu çalışmada, BSL-2 şartlarında gerçekleştirilebilen HCoV-229E kültürü ve kantitasyon çalışmalarının, BSL-3 şartları gerektiren SARS-CoV-2 deneylerinde bir ön çalışma modeli olup olamayacağının antiviral etkinlik analizleri üzerinden araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada HCoV-229E üretimi ve analizleri için MRC5 hücreleri, SARS-CoV-2 üretimi ve analizleri için Vero-E6 hücreleri kullanılmıştır. Üretim boyunca hücre morfolojileri ve CPE günlük olarak ters ışık mikroskobuyla incelenmiş ve üretim esnasında kültür süpernatantlarından alınan örneklerle kültürlerdeki logaritmik artış gösteren viral RNA yükleri, RT-PCR ile doğrulanmıştır. Ardından, virüs kantitasyonu için literatürde sıklıkla kullanılan PFU/ml ve laboratuvarımızda geliştirilen yeni bir yöntem olarak kristal viyole boyamasıyla revize edilen TCID50/ml kantitasyon testi gerçekleştirilmiştir. Antiviral analizler için klinikte SARS-CoV-2'ye karşı kullanılmış remdesivir, molnupiravir ve oseltamivir kullanılmış ve HCoV-229E ve SARS-CoV-2 üzerinde test edilen bu ilaçların etkinlikleri, virüs inokülasyonu öncesi ve sonrasında uygulanarak paralel kültürlerde çalışılmıştır. Uygulamalar sonucunda gruplardaki viral RNA baskılanmaları, kantitatif PCR yöntemiyle incelenmiştir. Remdesivirin SARS-CoV-2 üzerindeki antiviral etkisinin, HCoV-229E üzerindeki etkisinden en az 12 saat daha uzun sürdüğü ve ilacın HCoV-229E ile inoküle kültürlerde profilaktik olarak uygulanması durumunda ilk 24 saatte viral yükü baskılaması açısından daha etkin olduğu tespit edilmiştir. SARS-CoV-2 için remdesivirin uygulama zamanına (24 saat ya da 48 saat) bağlı bir farklılık gözlenmemiştir. İlk 24 saatte profilaktik olarak uygulanan molnupiravir ve oseltamivirin her iki virüse karşı antiviral etkinliğinin, virüs inokülasyonu sonrası kullanıma göre daha fazla olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, molnupiravir ve remdesivirin virüs inoküle kültürlerde hücre morfolojileri üzerinde sitotoksik bir etkisi bulunmazken, oseltamivirin hücre canlılığını etkileyen olumsuz etkileri ters ışık mikroskobuyla tespit edilmiştir. Sonuç olarak, SARS-CoV-2 ve HCoV-229E ile inoküle hücrelere in vitro olarak 10 μM dozunda profilaktik olarak uygulanan remdesivir ve molnupiravirin en yüksek antiviral etkinliğinin ilk 24 saatte gerçekleştiği, hücre canlılığı üzerinde en az sitotoksisiteye sebep olan ilacın ise remdesivir olduğu saptanmıştır. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 ile karşılaştırmalı olarak yürütülen HCoV-229E üretim, kantitasyon ve ilaç uygulama protokollerinin standardize edilmiş versiyonları yer almaktadır. Profilaktik olarak uygulanan tüm ilaçların 12 ve 24. saatlerde viral RNA yüklerini baskılaması, 48. saatteki değerlendirmeye göre her iki virüste de benzer bulunmuştur. Bu çalışmayla, SARS-CoV-2 için geliştirilen antiviral ilaç adaylarının HCoV-229E üzerinde de benzer etkilere sebep olarak HCoV-229E'nin SARS-CoV-2 çalışmalarında ön bilgi vermesi açısından bir model olabileceği sonucuna varılmıştır. Bu sebeple, SARS-CoV-2 ile ilgili yapılan çalışmalarda BSL-3 koşulları bulunmayan laboratuvarlarda, BSL-2 şartlarında üretimi ve testleri yapılabilen HCoV-229E'nin güvenli olarak kullanılabileceğine karar verilmiştir.