False-negative result in molecular diagnosis of SARS-CoV-2 in samples with amplification inhibitors

Abstract

ABSTRACT Introduction: Although reverse transcription-polymerase chain reaction (rRT-PCR) is the gold standard method for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), some factors, such as the presence of amplification inhibitors, lead to false-negative results Objective: Here we describe the differences between rRT-PCR results for SARS-CoV-2 infection in normal and diluted samples, simulating the need for dilution due to the presence of amplification inhibitors Material and method: Viral ribonucleic acid (RNA) from samples of nasopharyngeal swabs from 20 patients previously detected as "Negative"and 21 patients detected as "Positive"for SARS-CoV-2 was performed with the EasyExtract DNA-RNA kit (Interprise®) The rRT-PCR was performed with the OneStep/COVID-19 kit (IBMP), with normal and diluted (80 µl of H2O RNAse free) samples, totaling 82 tests Results: The results indicate that there is an average variation (a l0 05) delaying the Cq between the results of amplification of the internal control (IC), N gene (NG), and ORF1ab (OF), 1 811 Cq, 3 840 Cq, and 3 842 Cq, respectively Discussion: The extraction kit does not completely purify the inhibitor compounds;therefore, no amplified product result may occur In this study, we obtained a 19 04% false-negative diagnosis after sample dilution;this process reduces the efficiency of rRT-PCR to 29 8% in detecting SARS-CoV-2 Conclusion: Knowing the rRT-PCR standards of diluted samples can assist in the identification of false-negative cases and, consequently, avoid incorrect diagnosis RESUMEN Introduccion: Aunque la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa en tiempo real (rRT-PCR) sea el metodo de referencia para deteccion del coronavirus tipo 2 del sindrome respiratorio agudo grave (Sars-CoV-2), algunos factores como la presencia de inhibidores de amplificacion conducen a resultados falsos negativos Objetivo: Describimos las diferencias entre los resultados de rRT-PCR para infeccion por Sars-CoV-2 en muestras normales y diluidas, simulando la necesidad de dilucion debido a la presencia de inhibidores de amplificacion Material y metodo: La extraccion de acido ribonucleico (ARN) viral de muestras de hisopos nasofaringeos de 20 pacientes previamente detectados como "negativos"y 21 pacientes detectados como "positivos"para Sars-CoV-2 se realizo con el kit Easy Extract DNA-RNA (Interprise®) La rRT-PCR se realizo con el kit OneStep/Covid-19 (IBMP), con muestras normales y diluidas (80 µl de H2O libre de ARNasa), totalizando 82 pruebas Resultados: Los resultados indican que hay una variacion media (a l0,05) retrasando el ciclo de cuantificacion (Cq) entre los resultados de amplificacion del control interno (CI), gen N (GN) y ORF1ab (OF) de 1,811 Cq, 3,840 Cq y 3,842 Cq Discusion: El kit de extraccion no purifica completamente los compuestos inhibidores;por lo tanto, puede ocurrir no amplificacion Obtuvimos un diagnostico falso negativo de 19,04% despues de la dilucion de la muestra;ese proceso reduce la eficiencia de la rRT-PCR hacia 29,8% en la deteccion de Sars-CoV-2 Conclusion: Conocer los patrones de la rRT-PCR de muestras diluidas puede ayudar en la identificacion de casos falsos negativos y, por consiguiente, evitar un diagnostico equivocado RESUMO Introducao: Embora a reacao em cadeia da polimerase de transcricao reversa (rRT-PCR) seja o metodo padrao-ouro para deteccao de coronavirus da sindrome respiratoria aguda grave 2 (SARS-CoV-2), alguns fatores como a presenca de inibidores de amplificacao levam a resultados falso negativos Objetivo: Descrevemos as diferencas entre os resultados de rRT-PCR para infeccao por SARS-CoV-2 em amostras normais e diluidas, simulando a necessidade de diluicao devido a presenca de inibidores de amplificacao Material e metodo: A extracao de acido ribonucleico (RNA) viral de amostras de suabes nasofaringeos de 20 pacientes previamente detectados como "negativos"e 21 pacientes detectados como "positivos"para SARS-CoV-2 foi realizada com kit o EasyExtract DNA-RNA (Interprise®) A rRT-PCR foi realizada com o kit OneStep/COVID-19 (IBMP), com amostras normais e diluidas (80 µl de H2O RNAse-free), totalizando 82 testes Resultados: Os resultados indicam que existe uma variacao media (a l0,05) atrasando o Cq entre os resultados de amplificacao do controle interno (CI), gene N (GN) e ORF1ab (OF) de 1,811 Cq, 3,840 Cq e 3,842 Cq, respectivamente Discussao: O kit de extracao nao purifica completamente os compostos inibidores, portanto, pode ocorrer nao amplificacao Obtivemos um diagnostico falso negativo de 19,04% apos a diluicao da amostra;esse processo reduz a eficiencia da rRT-PCR para 29,8% na deteccao de SARS-CoV-2 Conclusao: Conhecer os padroes da rRT-PCR de amostras diluidas pode auxiliar na identificacao de casos falso negativos e, consequentemente, evitar um diagnostico incorreto