Ein Phosphotriester-Maskiertes Dideoxy-cGAMP-Derivat als Zellpermeabler STING-Agonist

Zyklische Dinukleotide, die ursprünglich in Bakterien entdeckt wurden, sind potente sekundäre Botenstoffe, die inzwischen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen nachgewiesen wurden.^{1, 2} Kürzlich wurde beobachtet, dass die Präsenz von pathogener DNA im Zytosol, entweder als Reaktion auf eine Virusinfektion oder aufgrund der Freisetzung von Kern- oder Mitochondrien-DNA, zur Bildung des zyklischen Dinukleotids 2′3′-zyklisches Guanosinmonophosphat-Adenosinmonophosphat (cGAMP) führt (1, Abbildung 1A).³ Das Molekül wird durch das Enzym Guanosinmonophosphat-Adenosinmonophosphat-Synthase (cGAS) nach dessen Bindung an DNA gebildet. cGAS zyklisiert ein Adenosintriphosphat und ein Guanosintriphosphat zu einem zyklischen Dinukleotid mit einer 2′-5′- und einer 3′-5′-Phosphodiesterbindung. Diese im Zytosol gebildete Struktur enthält zwei negative Ladungen. Es bindet eng an ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, den Stimulator der Interferon-Gene (STING), um eine angeborene Immunantwort auszulösen, die auf den angegriffenen Zustand der Zelle reagiert.^4-6

STING-Agonisten, die in der Lage sind, Zellmembranen zu überwinden, würden eine Möglichkeit bieten, das Immunsystem von außen zu stimulieren.⁷ Dies wiederum würde es ermöglichen, eine wirksame immunonkologische Behandlung als Teil einer Anti-Krebs-Therapie zu etablieren. Versuche, cGAMP oder dessen Derivate, bei denen die 2′- und 3′-Hydroxylgruppen durch Fluoratome oder die Phosphodiester durch Phosphothioate ersetzt wurden, zu diesem Zweck einzusetzen, waren jedoch bisher nicht erfolgreich.^8-14

Ein alternativer Ansatz besteht darin, die beiden Phosphodiester in Triester-Prodrugs umzuwandeln. Das beseitigt die Ladung, die das Eindringen in die Zelle behindert.¹⁵ Wenn der Triester in der Zelle in einen Diester gespalten werden könnte, würde dies die Freisetzung von cGAMP oder einem nahen Analogon und die Stimulierung des STING-Rezeptors ermöglichen. Ein gut etabliertes Konzept zur Maskierung von Phosphodiestern ist die Umwandlung in einen thioesterhaltigen Phosphotriester (Abbildung 1).^{16, 17} Bei der Abspaltung des Thioesters entsteht nur vier Atome vom Phosphotriester entfernt ein Thioat, das zur spezifischen Spaltung der gewünschten P−O-Bindung führt (Abbildung 1B). Dieses Konzept hat den Nachteil, dass die 3′- und 2′-Hydroxylgruppen in cGAMP die Phosphotriester in deren unmittelbarer Nähe schnell angreifen würde, was zu einer intramolekularen Spaltung der Triester und damit zur Instabilität der Prodrug führt. Um dieses Problem zu umgehen, müssen die 2′- und 3′-Hydroxylgruppen entweder entfernt oder z. B. in F-Atome umgewandelt werden. Wir beschlossen, in einem ersten Versuch das Konzept der Entfernung dieser internen Nukleophile zu untersuchen, was zu der Zielverbindung Dideoxy (dd)-cGAMP (2, Abbildung 1A) 3 (Abbildung 1A) führte, bei der beide Phosphodiester als Phosphotriester maskiert sind. Um eine mögliche spätere Funktionalisierung der Triester-Schutzgruppe zu erleichtern, z. B. für die Anbringung von dirigierenden Einheiten durch Klick-Chemie, um die Effizienz der Bereitstellung zu erhöhen, beschlossen wir, die Schutzgruppe mit einer zusätzlichen terminalen Alkinfunktionalität auszustatten, indem wir einen 5-Hexinsäurethioester (HTE) (Abbildung 1A) an die Phosphodiester anfügten. Auf diese Weise entsteht eine neue Thioester-Schutzgruppe, die durch Klickreaktion funktionalisiert werden kann. Wir haben bereits gezeigt, dass Klick-Reaktionen an Oligonukleotiden mit außergewöhnlicher Effizienz ablaufen.^18-20 Synthetisch haben wir zunächst die Referenzverbindung dd-cGAMP 2 hergestellt, über die wir bereits berichtet haben.²¹ Die Synthese des doppelt HTE-geschützten dd-cGAMP 3 begann mit Nukleosid 4 (Schema 1A), das gemäß den veröffentlichten Verfahren synthetisiert wurde (siehe Vorstufen in der SI).^21-24 Da wir einen Thioester zur Abschirmung der negativen Ladung der Phosphate verwenden wollten, mussten wir eine Schutzgruppenstrategie für die exozyklischen Amine von Guanosin und Adenosin finden, die mit den Thioestern kompatibel ist. Wir entschieden uns für eine photolabile Schutzgruppe (PSG), ein 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl-Derivat (Schema 1C), für die N2-Position von Guanosin und die N6-Position von Adenosin. Erstens ist diese PSG orthogonal zu anderen Schutzgruppen, die für die Synthese von 3 verwendet werden, zweitens ist sie während der gesamten Synthese von 3 stabil und drittens lässt sie sich leicht durch Licht entfernen. Wir verwendeten kommerziell erhältliches 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl (Schema 1C, 5) als Ausgangspunkt und stellten zunächst das aktivierte PSG 6 her. PSG 6 wurde dann mit einem Kronenether unter basischen Bedingungen an der N2-Position von 4 eingebaut, um das photolabil geschützte 3′-Deoxyguanosin 7 zu erhalten. Die TBS-Gruppen von 7 wurden entfernt, das 5′-Hydroxyl wurde als 4,4′-Dimethoxytritylether geschützt, und das 3′-Hydroxyl wurde phosphityliert, um Phosphoramidit 8 zu erhalten. Die HTE-Schutzgruppe (Schema 1D, 9) wurde mit 5-Hexinsäure 10 und 2-Mercaptoethanol 11 hergestellt und mit dem 5-(Benzylthio)-1H-tetrazol (BTT)-Aktivator an das Phosphoramidit 8 (Schema 1A) gekoppelt. Das Phosphoramidit wurde oxidiert und schließlich wurde die Dimethoxytrityl (DMTr)-Gruppe an der 5′-Position unter sauren Bedingungen entfernt, wodurch Phosphotriester 12 entstand. Als nächstes gingen wir zum 2′-Desoxyadenosin-Baustein über und beschlossen, dieselbe PSG, die wir für die N2-Position von Guanosin verwendet hatten, zum Schutz der N6-Position von Adenosin einzusetzen. Die aktivierte PSG 6 wurde in ähnlicher Weise wie beim 3′-Desoxyguanosin an das N6 des TBS-geschützten Adenosins 13 (Schema 1B) eingebaut. Die TBS-Gruppen wurden anschließend entfernt, und das 5′-Hydroxyl wurde als 4,4′-Dimethoxytritylether geschützt, um Adenosin 14 zu erhalten. Das Nukleosid wurde mit dem HTE-Phosphor-Reagenz 15 (hergestellt aus 9) phosphityliert, wodurch HTE-Phosphoramidit 16 entstand. Der Guanosin-Baustein 12 und der Adenosin-Baustein 16 wurden mit BTT an das Phosphor-Rückgrat des Adenosins und an das 5′-Hydroxyl des Guanosins gekoppelt. Durch Oxidation des Phosphoramidits und Entfernung der DMTr-Gruppe am 5′-Hydroxyl entstand das linear gekoppelte Dinukleotid 17. Die Cyanoethylgruppe wurde entfernt, gefolgt von einer Zyklisierung, die zu dem zyklischen Dinukleotid 18 führte. Schließlich wurden die PSGs entfernt, um bis-HTE-dd-cGAMP 3 zu erhalten.

Anschließend untersuchten wir, ob die neu entwickelten HTE-Phosphotriester-Schutzgruppen an 3 durch Carboxylesterase-1 (CES1) gespalten werden, ein Enzym, das in Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität wie Leberzellen, Monozyten, Makrophagen und Lungenzellen in erhöhtem Maße exprimiert wird und sogar in bestimmten Arten von Krebszellen wie Gallenblasen- und Leberkrebs überexprimiert ist.^25-27 Für das Experiment wurde 3 mit dem gereinigten CES1-Enzym inkubiert und die Reaktion mittels HPLC verfolgt (Abbildung 2A). Zu unserer Freude konnten wir feststellen, dass die HTE-Gruppen tatsächlich effizient gespalten wurden (Abbildung 2A). Das Enzym spaltet den Thioester, gefolgt von der erwarteten Spaltung der richtigen P−O-Bindung (Abbildung 1B). Deutlich sichtbar ist die zeitabhängige Reduktion von bis-HTE-dd-cGAMP 3 (orange gepunktetes Kästchen) und die gleichzeitige Bildung zunächst des mono-geschützten Zwischenprodukts (schwarz gepunktetes Kästchen), bei dem nur eine HTE-Gruppe gespalten wurde, und anschließend von dd-cGAMP 2 (blau gepunktetes Kästchen) mit seinen zwei negativen Ladungen (Abbildungen 2A und S1). Alle drei in der HPLC nachgewiesenen Spezies wurden während der Messung gesammelt und durch LC–MS-Analyse identifiziert (Abbildung S2). Wir konnten kein weiteres Reaktionsprodukt feststellen, was zeigt, dass die Spaltung ein sauberer Prozess ohne die Bildung von linearisierten Dinukleotid-Nebenprodukten ist. Solche Verbindungen würden auf eine unerwünschte P−O-Bindungsspaltung der 2′- oder 3′-Desoxyribose-Einheiten hinweisen. Als nächstes haben wir die intrazelluläre Spaltung der HTE-Gruppen untersucht. Für dieses Experiment behandelten wir THP1-Zellen mit bis-HTE-dd-cGAMP 3 und ernteten sie zu verschiedenen Zeitpunkten. Anschließend extrahierten wir die zellulären Metaboliten, stellten eine Fraktion mit angereicherten kleinen Molekülen her und analysierten sie mittels HPLC-MS (Abbildung 2B) unter Verwendung der entsprechenden Massenfilter. Nach 30 Minuten (Abbildung 2B, oben) kann ein Peak für 3 (Abbildung 2B, links) und ein kleiner Peak des Spaltprodukts 2 (Abbildung 2B, oben) nachgewiesen werden. Nach 4 Stunden (Abbildung 2B, unten) war bereits eine beträchtliche Menge von 3 in die vollständig entschützte Verbindung dd-cGAMP 2 umgewandelt. Eine kleine Menge der ursprünglichen Verbindung konnte jedoch immer noch nachgewiesen werden, wahrscheinlich aufgrund des permanenten Zustroms in die Zellen. Es ist zu beachten, dass das intrazellulär gebildete dd-cGAMP 2 zu diesem Zeitpunkt zwei negative Ladungen aufweist, was sein passives Entweichen durch die Zellmembran erschwert. Somit ist dd-cGAMP 2 gefangen und sammelt sich in der Zelle an.

Um die Fähigkeit der Verbindungen, STING zu aktivieren, zu messen, führten wir eine konzentrationsabhängige Studie der Interferon (IFN)-Reaktion durch. Zu diesem Zweck verwendeten wir die Reporterzelllinie THP1-Dual^TM (InvivoGen). Diese Zellen verfügen über eine sekretierte Luziferase unter der Kontrolle eines IFN-responsiven Promotors, so dass die STING-vermittelte Induktion des Signalwegs des IFN-regulatorischen Faktors (IRF) über eine Biolumineszenz-Auslesung überwacht werden kann. Um sicherzustellen, dass das Luziferase-Signal tatsächlich von der Aktivierung des STING-Signalwegs abhängt, wurden auch STING-defiziente THP1-Dual^TM KO-STING-Zellen (InvivoGen) mit demselben Reportersystem mit bis-HTE-dd-cGAMP 3 behandelt, wodurch die Abhängigkeit der IFN-Produktion von der Anwesenheit von STING vollständig bestätigt wurde (Abbildung S4).

Die erhaltenen EC₅₀ Kurven und Daten sind in Abbildung 3 und Tabelle 1 dargestellt. Wir haben den zuvor berichteten EC₅₀ Wert von dd-2′3′-cyclischem Adenosinmonophosphat-Adenosinmonophosphat (cAAMP) einbezogen, der 15-mal höher ist als die Desoxy-Version des natürlichen Liganden cGAMP.²¹ Die Stammverbindung dd-cGAMP 2 hat jedoch immer noch einen schlechten EC₅₀ Wert von 5 μM, was zeigt, dass sie kaum in der Lage ist, eine Immunantwort in cellulo und vermutlich auch nicht in vivo auszulösen. Zu unserer Freude stellten wir jedoch fest, dass bis-HTE-geschütztes dd-cGAMP 3 einen hervorragenden EC₅₀ Wert von 25 nM aufweist. Es ist eine Überraschung, dass die großen HTE-Schutzgruppen die zelluläre Aufnahme nicht behindern und dass sie außerdem innerhalb der Zelle so effizient gespalten werden.

Um ein umfassenderes Verständnis der globalen Auswirkungen unseres neuen Wirkstoffs auf Immunzellen zu erlangen, behandelten wir die unmodifizierte Stammzelllinie THP1 für 18 Stunden mit bis-HTE-geschütztem dd-cGAMP 3, bevor wir eine Proteomanalyse durchführten (Abbildung 4).

Die signifikante Hochregulierung von Proteinen, die rot hervorgehoben sind, zeigt die Gesamtauswirkung unserer Behandlung auf das zelluläre Proteom. Zur weiteren Untersuchung der biologischen Prozesse, die durch die Behandlung beeinflusst wurden, führten wir eine funktionelle Annotationsgruppierung mit Hilfe der Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) durch.²⁸ Die Analyse ergab, dass die hochregulierten Proteine hauptsächlich in drei Gruppen eingeteilt werden können, die alle mit immunologischen Prozessen in Verbindung stehen. Bemerkenswert ist, dass mit wenigen Ausnahmen alle hochregulierten Proteine mit mindestens einer dieser Gruppen verbunden sind, was die signifikante Auswirkung der Behandlung mit bis-HTE-geschütztem dd-cGAMP 3 auf immunologische Prozesse verdeutlicht. Eine umfassende Liste der Proteine in diesen Gruppen befindet sich in Tabelle S1.

Zusammenfassend berichten wir über die Synthese und biologische Bewertung von dd-cGAMP, bei dem die negativen Ladungen der verbindenden Phosphodiester durch Umwandlung in HTE-geschützte Phosphotriester entfernt wurden. Diese neutrale Verbindung zeichnet sich durch einen stark verbesserten EC₅₀ Wert aus, wodurch sie sich für die Entwicklung immunstimulierender Wirkstoffe eignet, die uns bei der Krebsbekämpfung mit Hilfe immunonkologischer Ansätze helfen kann. Studien zum Konjugieren von dirigierenden Liganden an Verbindung 3 mittels Klick-Chemie für eine effiziente Verabreichung sind im Gange.