Intérêt des sondes ARNc (ribosondes) synthétisés in vitro dans la détection des entérovirus par hybridation moléculaire

Abstract

Radioactively labelled RNA transcripts made in vitro of various fragments from cDNA clones of poliovirus type 1 and of hepatitis A virus under the control of bacteriophage T7 or SP6 promoters have been evaluated for diagnostic purposes. The RNA transcripts were 2 orders of magnitude more sensitive as hybridization probes than corresponding cDNA preparations labelled by the nick translation procedure.

A combination of hybridization analysis and sequence comparison showed that some regions of the genome of a number of enteroviruses are highly conserved, while others show very little homology; the general order of conservation is: 5′-non-coding>3′-terminal>central (2C)>VP3>VP1.

The 350 bases of the poliovirus VP1 region were highly specific for that virus, while the 450-bases of the 5′NC region showed extensive cross-reaction with other enteroviruses. However, these probes did not hybridize with HAV, which was detected only by HAV-specific riboprobes.

The transcripts have been successfully applied as hybridization probes in diagnostic tests on supernatants of infected cell culture lysates and in clinical samples, mainly in stool extracts.

Les ARN marqués transcrits des différents fragments de l'ADNc cloné du poliovirus type 1 et du virus de l'hépatite A (HAV) in vitro, sous le contrôle de promoteur du phage SP6 ou du phage T7, ont été évalués dans le diagnostic des entérovirus.

Les ARN transcrits sont 100 fois plus sensibles comme sondes dans les hybridations moléculaires que les ADNc correspondants marqués par la translation de coupure.

La comparaison d'hybridation avec des données de séquences a montré que certaines régions génomiques de différents picornavirus sont hautement conservées alors que d'autres régions ont très peu d'homologies. On a pu établir l'ordre général de conservation de 5 régions sous-génomiques: 5′-non-codante (5′NC)>3′-terminale>région centrale (2C)>VP3>VP1.

Les 350 bases de la région VP1 du poliovirus sont spécifiques de ce virus; les 450 bases de la région 5′NC montrent une forte hybridation croisée avec d'autres entérovirus. Aucune de ces sondes n'hybride avec le virus de l'hépatite A; ce virus a été détecté seulement avec les ribosondes transcrites de l'ADNc de HAV.

Les transcrits ont été des sondes sensibles dans les hybridations avec des surnageants des lysats des cellules infectées et même dans les spécimens cliniques, surtout avec des surnageants de selles. Nous proposons l'utilisation de ces ribosondes pour le diagnostic des entérovirus, comme une technique rapide, sensible et spécifique.