Inhibition de Gp96 comme stratégie anti-fibrotique dans la fibrose pulmonaire idiopathique et son suivi par l’imagerie SPECT in vivo de la Fibroblast Activation Protein

Abstract

Introduction

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie évolutive caractérisée par une production et un dépôt excessif de matrice extracellulaire (MEC) entraînant une insuffisance respiratoire chez les patients. Sous l’influence de cytokines pro-fibrotiques telles que le TGF-β1, les cellules pulmonaires vont acquérir un phénotype myofibroblastique caractérisé par l’expression de la Fibroblast Activation Protein (FAP) et une surproduction de MEC. Les options de traitement de la FPI sont limitées et ne peuvent que retarder la progression de la maladie sans l’arrêter. La Gp96 est une protéine chaperonne du réticulum endoplasmique surexprimée au cours de la fibrose et favorisant l’expression membranaire de nombreux récepteurs impliqués dans la fibrogenèse. L’inhibition de Gp96 apparait comme une stratégie thérapeutique intéressante dans la FPI et nous émettons l’hypothèse que l’imagerie in vivo des myofibroblastes via une sonde ciblant FAP pourrait permettre de suivre l’efficacité de ce type de traitement.

Méthodes

Des souris C57BL/6 (mâles, 8 semaines) ont reçu une administration unique intratrachéale de bléomycine (BLM, 1,5 mg/kg) ou de NaCl (n = 14) comme contrôle, puis ont été traitées ou non par un inhibiteur de Gp96 (PU-WS13, 12,5 mg/kg, gavage quotidien, n = 17) ou du NaCl (n = 16, gavage quotidien) de J₈ à J₂₂. La fibrose a été suivie longitudinalement par imagerie CT à J₈, J₁₅et J₂₂. À J₂₂, les poumons et les liquides de lavage bronchoalvéolaires (BAL) ont été récupérés pour quantification du collagène (Rouge Sirius, Sircol et Ashcroft score), immunomarquage de FAP (IHC) et dosage du TGF-β1 (ELISA). In vitro, des cellules A549 stimulées au TGF-β1 (2 ng/mL, 24 h) ont été traitées ou non par du PUWS13 (25/50 μM, 24 h) pour étudier l’expression de la protéine FAP (WB) et les interactions protéine-protéine entre Gp96 et FAP (Proximity ligation assay, PLA). Une sonde d’imagerie spécifique de FAP a été mise au point à partir d’un fragment d’anticorps anti-FAP couplé à un agent chélateur (DOTAGA) pour le radiomarquage à l’indium-111 pour l’imagerie par tomographie par émission monophotonique (SPECT). La sonde ¹¹¹In-DOTAGA-Fab-FAP a été injectée par voie intraveineuse à des souris C57BL/6 (100 μL, 10MBq, 25 μg). Les souris ont subi des imageries SPECT à 1 h, 4 h et 24 h post-injection à J₇et J₁₅. Des régions d’intérêt 3D ont été tracées sur le volume pulmonaire total (Vivoquant) afin de quantifier la fibrose (image CT) et l’accumulation de la sonde au niveau pulmonaire (SPECT) dans les différents groupes de souris (1/NaCl, 2/BLM et 3/BLM + PU-WS13).

Résultats

In vivo, nos résultats démontrent que le PU-WS13 inhibe l’accumulation de collagène, les lésions fibreuses à l’imagerie CT, l’expression de FAP et du TGF-β1 induits par la BLM. In vitro, le PU-WS13 diminue l’interaction entre Gp96 et FAP induisant sa dégradation. L’imagerie SPECT montre une augmentation de la captation du ¹¹¹In-DOTAGA-Fab-FAP dans les poumons des souris fibreuses comparés aux animaux témoins. Cette augmentation est inhibée par le PU-WS13 (Fig. 1).

Conclusion

L’inhibition de Gp96 représente une stratégie anti-fibrotique innovante. L’imagerie in vivo des myofibroblastes via la protéine FAP semble capable de suivre l’efficacité de cette thérapie dans notre modèle animal.