Changes in coagulation parameters and plasma cytokine concentration under the formation of neutrophil extracellular traps in vitro

Abstract

Введение. Внутрисосудистое формирование нейтрофильными лейкоцитами внеклеточных ДНК-сетей (англ. neutrophil extracellular traps, NETs) является одной из причин развития иммунотромбоза – тромбообразования, ассоциированного с реализацией иммунных механизмов резистентности. NETs выступают как интегральное звено, объединяющее в единый процесс функционирование систем иммунитета и гемостаза, что приобретает особое значение в зонах роста злокачественных новообразований. Цель исследования: уточнение патогенетической роли литического нетоза в процессе коагуляционного гемостаза, а также выявление изменения локальной концентрации основных цитокинов в условиях формирования NETs in vitro. Материалы и методы. Измеряли плазменную концентрацию цитокинов: интерлейкинов (англ. interleukin, IL) – IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, свободного активного трансформирующего фактора роста-β1 (англ. transforming growth factor, TGF-β1), фактора некроза опухоли-альфа (англ. tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), интерферона-γ (англ. interferon-γ, IFN-γ), хемокинов (CXCL8, CCL2, CXCL10), факторов I, II, III, IX, XI и XIII свертывания крови, а также методом тромбодинамики оценивали показатели коагуляции до и после экспериментального моделирования литического нетоза in vitro. Культуру нейтрофильных лейкоцитов и плазму получали из цельной венозной крови 30 больных с впервые выявленным раком толстого кишечника II–III стадии без метастазов. Группу сравнения составили 40 добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту, не имевших злокачественного процесса. Уровень цитокинов и факторов свертывания крови в образцах плазмы измеряли методом проточной цитометрии с использованием панелей мультиплексного анализа. Результаты. В обеих группах выявлено ускорение коагуляции на 5,5% и удлинение времени задержки роста фибринового сгустка без изменения концентраций I, II, III, IX и XIII факторов свертывания крови. Значимо увеличилось плазменное содержание CXCL8, IL-2 и свободного активного ТGF-β1 в образцах, где нейтрофилы погибли путем литического нетоза, в сравнении с исходным плазменным уровнем указанных молекул, а также в сравнении с образцами, содержавшими покоящиеся клетки. Заключение. Процесс литического нетоза нейтрофилов сопровождается ускорением I–III этапов коагуляции плазмы по внешнему пути и сопровождается значительным локальным повышением концентрации CXCL8 и в меньшей степени IL-2 и ТGF-β1, что потенциально может явиться одним из механизмов развития и поддержания хронической гиперкоагуляции и хронического воспаления, а также реализации проопухолевых свойств NETs. Background. Intravascular neutrophil extracellular traps (NETs) releasing represents one of the mechanisms of immunothrombosis – thrombi formation associated with immune reactions. NETs act as integrating link between immunity and hemostasis, thus acquiring particular importance in the sites of malignancy. Objectives: to reveal whether the suicide NETosis can modify clotting parameters and the plasma level of essential immunoregulatory factors in vitro. Patients/Methods. The plasma concentration of interleukins (IL) – IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, free active transforming growth factor (TGF-β1), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), chemokines CXCL8, CCL2, CXCL10 and I, II, III, IX, XI, XIII coagulation factors were measured before and after of experimental modeling of suicide NETosis in vitro. Coagulation process was assessed by thrombodynamics method. Cell culture of neutrophils and plasma were obtained from whole venous blood of 30 patients with newly diagnosed stage II–III colon cancer without metastases. The comparison group consisted of 40 healthy, age and gender matched volunteers. Plasma level of cytokines and clotting factors were measured by flow cytometry using multiplex assay panels. Results. Increasing of clotting rate by 5.5% and prolongation of lag-time were detected in both groups. There were no variations of coagulation factors level. The significant increase of plasma level of CXCL8, IL2 and free active TGF-β1 were detected in both groups in samples with netotic cells, when compared with their baseline concentration and with samples, contained resting cells. Conclusions. Suicide NETosis is accompanied by acceleration of initial stage of fi brin clot formation through external way and by strong increase in CXCL8 concentration and less increase in IL-2 and TGF-β1 that can be considered as one of the ways how NETs contribute to hypercoagulation state and chronic inflammation development and also implement their tumorgenicity.