Kinetic and inhibitory study of partially purified lipoxygenase from epilepsy patients serum

Abstract

This research was included partially purification of lipoxygenase (LOX) from serum of patients with epilepsy using ammonium sulfate precipitation, dialysis and ion-exchange chromatography with specific activity (0.751 U / mg), (0.935 U/mg) and (2.60 U/mg) respectively. Optimum conditions for enzyme activity were determined. The best enzyme activity was showed at 7 minutes of incubation time, 3 minutes of reaction time, pH = 7, temperature 40Co and finally substrate concentration (linoleic acid) was (1.2 mmol/L). By applying Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk Equations, Michaelis-Menten constant (km) and Vmax values were found 0.3 (mM) and (0.9 U/ml) respectively. Also this study included the effect of some antiepileptic drugs such as valproic acid, carbamazepine and acetozolamide. Acetazolamide showed the highest inhibition of lipooxygenase activity ( 96.2 )٪ , valproic acid(95.6) and Carbamazapine ( 95.1 )٪ . Inhibition type was studied and the result showed noncompetitive inhibition by using Lineweaver-Burke plot for all above drugs. Keyword: Epilepsy, Lipoxygenase, inhibition, purification, antiepileptic drugs عرصلا ىضرم مد لصم نم ايئزج ىقنملا زينيجيسكواوبيللا ميزنلإ ةيطيبثتو ةيكرح ةسا رد ضايفلا حلاص يلع دمحا * 1 و نيهاش وبع ميها ربا ناوشن 2 1 * ةيبرتلا ةرا زو , ىونين ةظفاحم ةيبرت ةيريدم 2 ءايميكلا مسق , ةفرصلا مولعلل ةيبرتلا ةيلك , لصوملا ةعماج ةصلاخلا موينوملاا تاتيربكب بيسرتلا ةينقت مادختساب عرصلاب نيباصملا ىضرملا مد لصم نم ايئزج زينجيسكواوبيللا ميزنإ ةيقنت ةسا ردلا تنمضت ةيعونلا ةيلاعفلا تناك , ينويلاا لدابتلا ايفا ركوتوموركو يئاشغلا زرفلاو ( 0.751 U/mg ( ) 0.935 U/mg ( ) 2.60 U/mg ) ىلع ظلا تددح .يلاوتلا ناو , نضحلا نمز نم ةعباسلا ةقيقدلا دنع ميزنلال ةيلاعف ىلعا نا جئاتنلا ترهظاو ميزنلاا ةيلاعفل ىلثملا فور ينيجورديهلا سلاا ،قئاقد ثلاث للاخ لعافتلا نمز pH =7.4 ةرا رح ةجرد, 40 oC ( )كيلونيللا ضماح( ساسلاا ةداملا زيكرتو 1.2 سليكيم يتلداعم قيبطتب ,)رتل/لوم يلم رفيونيلاو نتنيم – ىوصقلا ةعرسلاو نوتنيم سلكيم تباث ،كريب 0.3mM و 0.9 U/ ml Journal of Education and Science (ISSN 1812-125X), Vol: 30, No: 1, 2021 (58-71) Downloaded from https://edusj.mosuljournals.com/ 59 .ديملاوزوتيسلاا , نيبا زامابراك , كيوربلاف ضماح لثم عرصلل ةداضملا ريقاقعلا ضعب ريثأت ةسا رد ةسا ردلا تنمضت كلذك . يلاوتلا ىلع ذإ طيبثت ةبسن ىلعا ديملاوزوتيسا راقع رهظا ( 96.2 )٪ اعفل كيوربلاف ضماح ،زينجيسكواوبيللا ميزنا ةيل ( 95.6 )٪ نيبا زامابراكلاو ( 95.1 )٪ ةلداعم مادختساب جئاتنلا ترهظأو طيبثتلا عون ةسا رد تمت . رفيونيل كرب ريقاقعلا عيمجلو يسفانت ريغ طيبثتلا نا هلاعأ . صلل ةداضم ةيودأ ،طيبثت ،ةيقنت , زينجيسكواوبيل , عرصلا : ةلادلا تاملكلا .عر ةمدقملا Introduction رابكو رافطلاا يف اعويش رثكاو رامعلاا عيمجب ثانلااو روكذلا بيصي يزكرملا يبصعلا زاهجلا يف عئاش با رطضا وه عرصلا نسلا [1] )ممعملا(ماعلا عرصلا نيعون ىلا عرصلا فينصت نكميو . Generalized ) يرؤبلا( يئزجلا عرصلاو Focal تابون رثؤت ذإ ايلاخلا نم ةعومجم ىلع ماعلا عرصلا بناج ىلع ايلاخ ةعومجم يف أدبت ام ةداع يرؤبلا عرصلا ةبون اما , غامدلا يبناج لاك يف ابا رطضا ببسي امم غامدلا يف يبصعلا طاشنلا يف طا رفلاا وا نما زتلا وا ذوذشلا قيرط نع عرصلا تابون أشنتو , غامدلا نم دحاو تقؤم ا يعيبط لكشب غامدلا اهب لمعي يتلا ةقيرطلا يف [2] , ةرربم ريغ دحاو ةبون دعب ثدحي دق عرصلا نا دجو Unprovoked يف ةمدصلا وا , يزكرملا يبصعلا زاهجلا ىودع , ةيغامدلا ةتكسلا لثم ةنيعم ةيريرس تلااح .[3,4] تاباصلاا ةجيتن عرصلا ثدحي ذإ ,ما رولااو ىودعلا دعب امو سا رلا ةباصا كلذ يف امب غامدلا تاهوشت وا زجعلا وا ةيبصعلا نإ 20 30 فورعم تلااح يه % ة وا اهب هبتشم [5] نأ نيح يف ـلا 70 80 , غامدلا ةباصاو ةينهذلا ةقاعلااو حضاولا يبصعلا زجعلا ببسب ةبوبيغلا ةلاح نم أشنتف % سيئر ا رود بعلت )ةينيجلا( ةيثا رولا لماوعلا ا ببسلا لوهجم عرصلل ببسمك [6,7] ه ةرفوتملاو ةحاتملا جلاعلا تا رايخ نإ . ةيودلاا ي يبصعلا زيفحتلا تاجلاعو ينوتيكلا يئاذغلا ماظنلاو عرصلل ةداضملا [5] . تاميزنا Lipoxygenases LOXs EC 1.13.11.12) ) , نيجسكوا ةئيزجو يميهلا ريغ ديدحلا اهبيكرت يف مضت تانيتورب زفحت .تاناويحلاو تاتابنلا يف عساو قاطن ىلع رشتنت LOXs ةعبشملا ريغ ددعتملا ةينهدلا ضامحلاا ىلا نيجسكوا يترذ ةفاضإ ىلع يوتحت يتلا cis –cis-1,4-pentadiene ةينهدلا ضامحلاا تاديسكوريبورديه جاتنلإ [8,9] نا تاسا ردلا ضعب تنيب و , هم ا رود بعلي زينجيسكواوبيللا ميزنا ىعدت ةيجولويبلا ةيلاعفلا ةينهدلا ةيطسولا تابكرملا نم ديدعلا ديلوت للاخ نم تاباهتللاا يف ام تانيا رتوكيللا Leukotriens (LTs) [10] ميزنا لمعي . LOX ىلا كينوديكا رلاا ضماح ليوحت ىلع HPETE) hydroperoxyeicosatetraenoic acid (5 5 يا رتوكيللا نوكيل ةعرسب لوحتي يذلا ن 4 A 4 leukotriene A ( 4 LTA ليوحت متي مث ) ( 4 LTA ) ىلا 4 C leukotriene ( 4 LTC ) ةطساوب synthase 4 C leukotriene ( synthase 4 LTC و ) ىلا 4 B leukotriene ( 4 LTB ) ةطساوب hydrolase 4 A leukotriene ( hydrolase 4 LTA ) ليوحت نكميو ( 4 LTC ) دعبا ىلا ىلا هليوحت متي ثيح كلذ نم 4 D leukotriene ( 4 LTD و ) 4 E leukotriene ( 4 LTE ) امك ىرخا تاميزنا ةطساوب م وه ضو ح يف ( لكشلا 1 ) [11] زيكرت يف ةدايز ىلع روثعلا مت 4 LTD يغامدلا يومدلا زجاحلا للخ ي [12] باصعلاا باهتلا هب طبتري يذلا عرصلا ضرمو [13] يراسم تاطبثم ناو . LOX\COX Lipoxygenase\ Cycloxygenase تانيا رتوكيلا ضافخنا ىلا ريشت عرصلا تابون نيوكت ليلقت يف ا رود بعلت يتلا [14,15] . Journal of Education and Science (ISSN 1812-125X), Vol: 30, No: 1, 2021 (58-71) Downloaded from https://edusj.mosuljournals.com/ 60 ( لكش 1 :) تانيا رتوكيلل يويحلا قيلختلا [16] ثحبلا نم فدهلا Aim of the research زينيجيسكواوبيللا ميزنا ةيقنت ضعب ريثأت نع فشكلا مث نمو ةيلاعفلا ىلع ةرثؤملا ىلثملا فورظلا ةسا ردو عرصلا ىضرم مد لصم نم ةيميزنلاا ةيلاعفلا ىلع عرصلل ةداضملا ةيودلاا لمعلا قئا رطو داوملا Materials and methods 1 زينجيسكواوبيللا ميزنا ةيقنت LOX ةنيعلا ريضحت تعمج : 10 ىفشتسمل ةيبصعلا ةلمجلا ةدحو يف يبط فا رشإب نيصخشم عرصلاب نيباصم روكذ ىضرمل تانيع ا ب ن ىونين ةظفاحم يف يميلعتلا انيس ( رامعإب 25 45 بحس مت ذإ ) 5 رابتخا بيبانأ يف عضو مث نمو باصم لك مد نم رتيليلم دربملا ةعرسلا قئاف يزكرملا درطلا زاهج يف مدلا لصم لصف ،مدلا رثخت داضم ىلع ةيواح ريغ ( Ultra – cooling Centrifuge ) ةكرش نم Heraeus –christ Gmbh ةعرسب .ةينامللأا 3000xg ةدمل 10 min ةقيقدلا ةصاملا ةطساوب مدلا لصم بحس اهدعب ةرا رح تاجردب يف ظفح مث , ةفاج ةيكيتسلاب بيبانأ يف عضوو 4 o م [17,18] . يلكلا نيتوربلا نلوف ةقيرط عابتاب نيتوربلا ةيمك تردق : – يرولا Folin –Lowry method نيثحابلا لبق نم ةروحملا [19] . ميزنا ةيلاعف LOX : ثحابلا ةقيرط عابتاب عرصلا ىضرم مد لصم نم ايئزج ىقنملا زينجيسكواوبيللا ميزنا ةيلاعف تردق [20] يجوم لوط دنع ةيصاصتملاا يف ةدايزلا ةعباتمبو ساسا ةدامك كيلونيللا ضماح مادختساب 234nm .تانييادلا نيوكت نع ةجتانلا 2 ةيقنتلا تاوطخ : ذخا 11 ةعومجم لصم نم لم ةيقنتلا تاوطخ اهيلع تيرجاو ىضرملا نم ةيتلآا : 1 زيكرتب نيتوربلا بسر :موينوملاا تاتيربكب بيسرتلا 65 ةجردب كرت اهدعب ةيجيردتلا ةفاضلإاب ةعبشملا موينوملاا تاتيربك % ةرا رح 4 o م 24 ةعاس [21] ةعرسب دربملا يزكرملا درطلا زاهجب بسا رلا لصف ، 3000xg ةدمل 15 min , حشا رلا لمهُا FLAP=five-lipoxygenase activating protein CysLT=cysteinyl-leukotrienes,5LO 5lipoxygenase Journal of Education and Science (ISSN 1812-125X), Vol: 30, No: 1, 2021 (58-71) Downloaded from https://edusj.mosuljournals.com/ 61 زيكرتب مظنملا تافسوفلا لولحم نم ةيمك لقاب هتباذإ مت و بسا رلا ذخاُو 20mmol دنع pH = 6.8 ةيمك تردقُ اهدعب , .ميزنلأا ةيلاعفو نيتوربلا 2 بسا رلا لولحم يقن :يئاشغلا زرفلا يئاشغلا زرفلا سيك مادختساب ينيتوربلا [21] دنع مظنملا تافسوفلا لولحم دض pH = 6.8 ةرتف 24 لك مظنملا لولحملا ليدبت ةاعا رم عم يجلث مامح يف ةعاس 5 ةيلاعفو نيتوربلا ةيمك تردقُ اهدعب , تاعاس . ميزنلأا 3 بلاسلا ينويلاا لدابملا مادختساب ةيقنتلا [22] DEAE-cellulose A50 داعبأب لصفلا دومع مادختساب ةيقنتلا تمت : 2.5x40 cm دنع مظنملا تافسوفلا لولحم را رمإب pH=6.8 عقاوب ءا زجلاا تعمج مث , را رمتساب 5 نايرج لدعمب رتيليلم 60 .هيف ميزنلاا ةيلاعفو نيتوربلا ةيمك تردقُ اهدعب ,ةعاس/لم . ةيقنتلا ةيلمع ءا رجا دعب ميزنلاا ةمزح تعمج 4 ا لأ ىلثملا فورظل ميزن زينجيسكواوبيللا LOX : ،ةرا رحلا ةجرد ،ميزنلاا زيكرت نم لك ريثأت سردُ ةلادلا نمز ،ةيضماحلا ـل ةيميزنلاا ةيلاعفلا ىلع ساسلاا ةداملا زيكرتو لعافتلا نمز ،نضحلا LOX . ايئزج ىقنملا 5 ميزنا طيبثت LOX : ةيلاعف ىلع ديما زلاوتيسا و نيبا زامابراك ، كيروبلاف عرصلل ةداضملا ريقاقعلا ضعب ريثأت ةسا رد تمت LOX ( اهنم ةفلتخم زيكا رت ريضحتب 5 , 10 , 15 , 20 , 25 , 30 , 35 .لثملاا يطيبثتلا زيكرتلا ديدحتل رلاوم يلم ) فيضا 100 ميزنلاا ةنيع ىلا طبثملا نم رتيلوركيام [23] ةرقفلا يف امك ةيلاعفلا تسيق اهدعب 1 . ةشقانملاو جئاتنلا Results and discussion 1 . زينجيسكواوبيللا ميزنا ةيقنت ( لودجلا حضوي 1 ا جئاتن ترهظاو عرصلاب نيباصملا ىضرملا مد لصم نم ايئزج زينجيسكواوبيللا ميزنا ةيقنت جئاتن ) بيسرتلاب ةيقنتل عبشت ةجردب ماخلا صلختسملا لولحم ىلإ ايجيردت اهتفاضإ دنع ةبلصلا موينوملاا تاتيربكب 65% ميزنلإ ةيعونلا ةيلاعفلا نا , LOX ىلا بيسرتلا دعب تدادزا ( 0.751 U/mg ) ماخلا ميزنلإل ةيعونلا ةيلاعفلاب ةنراقم بيسرتلا لبق تناك يتلاو ( 0.183 U/mg ) نا يا ( رادقمب بيسرتلا دعب تدادزا ةيقنتلا تا رم ددع 4.1 ( تغلب ميزنلإل ةيلكلا ةيلاعفلا عاجرتسا رادقم ناو ةرم ) 156.83% ةنراقملاب ) اهدعب .ماخلا ميزنلإل ةيلكلا ةيلاعفلا عم تلمعتسا قبتملا نم صلختلل )ةزليدلا( يئاشغلا زرفلا ةينقت ةيقبو موينوملاا تاتيربك نم ي نم لقلاا ةيئيزجلا نا زولاا تاذ تابكرملا 10 kD تحبصأف زينجيسكواوبيللا ميزنلإ ةيعونلا ةيلاعفلا عافترا ظحول ذا ةيقنتلا ةدايزل ( 0.935 U/mg ) (رادقمب تفعاضت اهنا يا 5.1 ةيلكلا ةيلاعفلا عاجرتسا رادقم اما ,ةيقنتلا لبق ةيلع تناك امع ةرم ) غلب ميزنلإل ( 171.9% ةيميزنا ةينيتورب ةمزح ترهظو ينويلاا لدابتلا ايفا رغوتومورك ةينقت تمدختسا اهدعبو .ماخلا ميزنلإل ةيلكلا ةيلاعفلاب ةنراقم ) ( لكشلا يف حضوم وه امك ةدحاو 2 ةيعون ةيلاعفب ) ( 2.60 U/mg ) ناغور مجحبو Elution volume ( 15-23 ml هذه نم ) نا نيبت ةجيتنلا ( رادقمب ينويلاا لدابتلا ةيلمع دعب تفعاضت ةيقنتلا تا رم ددع 14.2 غلب ةيلكلا ةيلاعفلا عاجرتسا رادقم ناو , ) (221.81%) زينجيسكواوبيللا ميزنلإ ةيعونلا ةيلاعفلا نا ميزنلاا اهيف يقن ةسا رد يف دجو نيح يف ماخلا لصملا يف هيلع وه امم برلاب ضيرم مد لصم نم ايئزج ىقنملا ( تناك و 2.68 U/L ) ( ةيقنت تا رم ددعب 10.3 لدابتلا ايفا رغوتومورك ةينقت مادختسا دعب ) ينويلاا [24] دجو امك , [25] ينويلاا لدابتلا ةينقت مادختساب ةيعونلا ةيلاعفلا نا 4 1230×10 ددعب , نيتورب مغلم /ةيميزنا ةدحو فعاضت تا رم 18.08 تابن ةرشق صلختسم نم ىقنملا ميزنلإل يربلا قتسفلا . Journal of Education and Science (ISSN 1812-125X), Vol: 30, No: 1, 2021 (58-71) Downloaded from https://edusj.mosuljournals.com/ 62 ( لودجلا 1 ميزنا ةيقنت لحا رم نيبي ) LOX عرصلا ىضرم لصم نم ةيميزنلأا ةدحولا * U : ةداملا نم ادحاو لاوموركيام دسكؤي يذلا زينجيسكواوبيللا ميزنأ ةيمك ىلإ ريشت ةدحاولا ة