Le canal osmo-sensible LRRC8A et les récepteurs purinergiques P2Y des macrophages occupent une place centrale dans l’inflammation microcristalline

Introduction

L’inflammation induite par les cristaux d’urate de sodium (UMS) et de pyrophosphate de calcium (PPC) dépend de l’interleukine (IL)-1β dont la production est régulée par l’inflammasome NLRP3. NLRP3 peut être activé par des variations de l’osmolarité. Lors d’un stress hypotonique extracellulaire, il se produit un gonflement cellulaire par entrée d’eau osmo-induite, suivi d’un mécanisme de régulation, appelé regulatory volume decrease (RVD), permettant un retour au volume initial. Ce mécanisme RVD dépend du canal anionique LRRC8. Nos objectifs sont de déterminer comment le canal osmo-sensible LRRC8 régule l’inflammation induite par les cristaux.

Matériels et méthodes

In vitro, les monocytes de la lignée humaine THP1, les macrophages murins isolés de la moelle osseuse (BMDM) sont stimulés par des cristaux synthétiques dans des milieux de culture iso-, hypo- ou hypertoniques. Le rôle du canal LRRC8A est évalué en utilisant un inhibiteur pharmacologique (DCPIB) et des cellules dont l’expression de LRRC8A est délétée par shRNA ou knock-down (KO). La production des cytokines inflammatoires et de l’ATP est dosée par ELISA. Les courants chlorure et ATP sont enregistrés par patch-clamp. La taille des cellules est évaluée par méthodes de fluorescence. In vivo, l’inflammation a été évaluée dans le modèle de poche à air sur des souris sauvages (notées Lrrc8Acont) et des souris dont LRRC8A est invalidé dans la lignée macrophagique (notées Lrrc8AΔMo).

Résultats

Les liquides articulaires prélevés au cours de l’inflammation microcristalline (goutte et PPC) avaient une concentration en IL-1β et IL-8 plus forte que les liquides d’arthrose. En revanche, leur osmolarité était plus basse et inversement corrélée à la concentration des cytokines. Dans le modèle murin, l’augmentation de l’osmolarité plasmatique par injection de mannitol diminuait l’inflammation induite par les cristaux, en termes d’infiltrat cellulaire et de production des cytokines inflammatoires. L’inhibition des aquaporines par du chlorure de mercure (HgCl2) diminuait également l’inflammation microcristalline. In vitro, les cellules THP-1 et BDMD traitées par HgCl2 diminuaient de façon substantielle la production d’IL-1β et l’activation de l’inflammasome NLRP3 induites par les cristaux. De plus, la production de l’IL-1β était diminué lorsque les cellules étaient cultivées en milieu hypertonique et augmentées en milieu hypotonique. Les cristaux induisaient une augmentation du volume cellulaire suivi d’un retour au volume initial, mimant le phénomène de RVD induit par une stimulation hypotonique. Celle-ci induisait la production d’un courant chlorure sortant suggérant l’implication du canal LRRC8. Ce phénomène de RVD et le courant chlorure n’étaient plus observés dans les cellules dont l’expression de LRRC8A est délétée ou dans les cellules traitées par DCPIB. In vivo, l’inflammation induite par les cristaux d’UMS et de PPC était diminuée chez les souris Lrrc8AΔMo par aux souris Lrrc8Acont. Les BMDM isolés souris Lrrc8AΔMo produisaient moins d’IL-1β par rapport aux BDMD isolés des souris Lrrc8Acont. Enfin, nous observons que les cristaux d’UMS et de PPC induisaient une libération extracellulaire d’ATP via le canal LRRC8. Cette libération d’ATP précédait le phénomène de RVD et était nécessaire à l’activation de l’inflammasome NLRP3 et de la production de l’IL-1β via les récepteurs purinergiques P2Y et le calcium intracellulaire.

Conclusion

Nos résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de l’inflammation microcristalline avec un rôle central du canal osmo-sensible LRRC8 et des récepteurs purinergiques P2Y (Fig. 1) au cours des crises microcristallines, les cristaux et l’hypo-osmolarité du liquide articulaire induisent un gonflement des macrophages, ce qui active le canal anionique régulateur de volume (VRAC) LRRC8 aboutissant à la libération de l’ATP. L’ATP par action paracrine et autocrine active les récepteurs purinergiques P2Y2 et P2Y6 qui via la phospholipase C (PLC) et le calcium intracellulaire participe à l’activation de l’inflammasome NLRP3 et à la production de l’IL-1β.