Investigation of lipid bodies in a colon carcinoma cell line by confocal Raman microscopy

Abstract

Objective

The investigation of living cells under physiological conditions requires sensitive, sophisticated and in particular, non-invasive methods. Raman spectroscopy provides vibrational information about the sample. Combined with high-resolution confocal microscopy, it allows a complete Raman spectrum to be recorded at every confocal image point. This technique was applied here for the investigation of lipid bodies in a colon carcinoma cell line.

Materials and methods

The colorectal adenocarcinoma cell line Caco-2 and the rat intestine epithelial cell line IEC-6 were analysed with the confocal Raman microscope alpha300 R (WITec GmbH, Germany), using a frequency-doubled Nd:YAG laser at 532 nm and 10 mW for excitation. The use of a water immersion lens (63×, NA 1.0) allowed a lateral resolution in the sub-micrometer range. Raman images of cells were generated from the data sets by integrating over specific Raman bands. Mapping of the C–H stretching band (2800–3030 cm⁻¹) allowed for the visualisation of the whole cell, whereas the automated statistical evaluation of all spectra by k-means cluster analysis resulted in spectral unmixed images which provided an insight into the chemical composition of the sample.

Results

With the described method, it was possible to visualise the distribution of different cellular biomarkers. Lipid bodies, in particular, which are reported to be present in increased numbers in colorectal cancer cells as compared to normal tissue, could be characterised and localised. A quantitative approach was developed to assess the fraction of lipid bodies in the total cell area. This method was applied for comparison between malignant and non-malignant cell lines. The fraction of lipid bodies turned out to be significantly higher in malignant (13.8%, n = 21) than in non-malignant cells (1.8%, n = 16).

Conclusion

Confocal Raman microscopy is shown to be a powerful method for the investigation of lipid bodies.

Hintergrund und Zielsetzung

Die Untersuchung von lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen erfordert sensitive und nicht-invasive Methoden. Die Raman-Spektroskopie liefert über das Schwingungsverhalten von Molekülen Informationen über die chemische Komposition einer Probe. Die Kombination mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie generiert ein komplettes Raman-Spektrum in jedem einzelnen konfokalen Bildpunkt. Diese Methode wurde angewendet um Lipid-Bodies in einer Kolonkarzinom-Zelllinie und in normalen Darmepithelzellen zu charakterisieren.

Materialien und Methoden

Die Adenokarzinom-Zelllinie Caco-2 und die Ratten-Darmepithel-Zelllinie IEC-6 wurden mit dem konfokalen Raman-Mikroskop alpha300 R (WITec GmbH, Ulm, Deutschland) unter Anregung durch einen Frequenz-verdoppelten Nd:YAG-Laser (532 nm, 10 mW) untersucht. Ein 63× Wasserimmersions-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,0 ergibt hierbei eine laterale Auflösung unter 1 μm. Raman-Bilder von Zellen wurden durch Integration über spezifische Raman-Banden generiert. Die Integration über die C–H-Streckschwingungsbande (2800–3030 cm^-1) ergibt Bilder des gesamten Zellareals, während die automatisierte statistische Analyse aller Spektren mit k-Means-Clusteranalyse die Verteilung von Regionen mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung wiedergibt.

Ergebnisse

Mit der beschriebenen Methode kann die Verteilung von verschiedenen Biomarkern innerhalb der Zelle dargestellt werden. Insbesondere Lipid-Bodies, die laut Literatur im Vergleich mit normalem Gewebe in kolorektalen neoplastischen Zellen vermehrt vorkommen, konnten charakterisiert und lokalisiert werden. Um den Anteil der Lipid-Bodies in Relation zur gesamten Zelloberfläche zu berechnen, wurde ein quantitatives Verfahren erarbeitet. Der Anteil an Lipid-Bodies in malignen Zellen (13.8%, n = 21) erwies sich als signifikant höher als in nicht-neoplastischen Zellen (1.8%, n = 16).

Schlussfolgerung

Die konfokale Raman-Mikroskopie erweist sich als eine effiziente Methode für die Untersuchung von Lipid-Bodies in Kolonkarzinomzellen.