Wide-field, high-resolution two-photon tissue mapping of human skin ex vivo

Abstract

Background and objectives

Two-photon microscopy (TPM) generates high definition images from biological samples such as human skin in a non-invasive way. The focus of an ultrashort pulsed laser is scanned through the tissue and the fluorescence photons induced by two-photon excitation of endogeneous fluorophores are collected, measured and displayed as a scanning image. So far, one of the main disadvantages of TPM is the limitation of the scanning area to tenths of a millimeter by the field of view of the focusing optics. Essential pieces of information, such as the differentiation between benign or malign changes in biological tissue, are therefore not captured. Within a BMBF-supported research project “FluoTOM”, a new modified TPM scanning technique was developed to overcome these shortcomings, and pilot tests have been made on benign and malignant samples of human skin ex vivo.

Material and methods

The field of view of the new TPM was extended from the current standard of <500 μm to >5 mm. The spectral band option allows the synchronous recording of one to four images with exact local congruence, using photons from a choice of different spectral windows. These images are finally merged into a false-color presentation for interpretation. The spectral wavelengths can be chosen in the range of 350–650 nm according to a specific diagnostic question. Real-time photography is used as an adjunctive method to locate the scan position with respect to the sample to be examined. Samples under investigation were unstained tissue slides or full paraffin-embedded biopsy/tissue blocks. The images obtained by our new method were subsequently compared with standard H&E histology.

Results

Vertical laser scan images of superior quality from unstained histological slides as well as from the paraffin blocks of different benign and malignant cutaneous samples were made. When directly compared to the routine H&E histology, which is the gold standard, relevant tissue structures and changes in the normal architecture could be clearly identified and confirmed respectively.

Conclusion

A new non-invasive TPM scanning technique has been established that provides high-resolution imaging of biological tissue, such as human skin, in a distortion-free way and with a diagnostic relevant imaging size, thus allowing the assessment of tissue-significant medical issues in greater detail. Current use of our new method ex vivo shows that it is particularly appropriate for diagnosis and research applications of human skin.

Hintergrund

Zwei-Photonen-Mikroskopie (2PM) erzeugt bekanntlich nicht-invasiv hochaufgelöste Bilder aus dem Volumen von biologischem Gewebe. Der Fokus eines ultrakurz gepulsten Lasers führt hierbei zur sogenannten Zweiphotonenanregung endogener Fluorophore, deren Emissionen gesammelt, gemessen und als Scanbild dargestellt werden können. Bedingt durch das eingeschränkte Bildfeld der fokussierenden Optik ist die Scanfläche der 2PM bislang auf Zehntelmillimeter beschränkt. Entscheidende Informationen, die z.B. eine Unterscheidung von benignen und malignen Veränderungen ermöglichen würden, werden daher nicht erfasst. Um diese Nachteile zu überwinden, wurde im Rahmen eines BMBF-geförderten Forschungsprojekts (“FluoTOM”) ein modifiziertes 2PM-System entwickelt und Pilotversuche an Ex-vivo-Gewebeproben gut- und bösartiger Hautveränderungen durchgeführt.

Material und Methode

Durch technische Modifikationen konnte das Bildfeld von derzeit standardmäßig <500 μm auf >5 mm ausgedehnt und die Bildqualität in ihrer Beurteilbarkeit entscheidend gesteigert werden. Eine Bildgebungsoption mit Spektral-Band-Diskriminierung erlaubt es, mehrere exakt deckungsgleiche Bilder mittels Photonen unterschiedlicher Spektralkanäle synchron zu erzeugen, die zur visuellen Interpretation zu einem Falschfarbenbild fusioniert werden können. In Abhängigkeit von der spezifischen Fragestellung können die spektralen Fenster in einem Wellenlängenbereich von 350–650 nm ausgewählt werden. Eine eindeutige Zuordnung der Scanbilder zur Lokalisation an der Probe wird durch ein Situs-Foto gewährleistet.

Untersucht wurden ungefärbte Gewebeschnitte oder in Paraffinblöcke eingebettete Biopsie-/Gewebeproben. Die erzielten Bilder wurden anschließend mit herkömmlichen histologischen H&E-Schnitten bezüglich ihrer Aussagefähigkeit verglichen und bewertet.

Ergebnisse

Hochauflösende Bilder von histologischen Schnitten sowie Paraffinblöcken gut- wie bösartiger Hautveränderungen konnten gewonnen werden. Im Vergleich mit histologischen H&E-Schnitten ließen sich krankheitsrelevante Veränderungen identifizieren.

Zusammenfassung

Es wurde eine neue, nicht-invasive 2PM-Scanner-Technik präsentiert, die hochauflösende Bilder von biologischem Gewebe, wie bspw. der Haut, in verzerrungsfreier Darstellung und mit diagnostisch relevanter Bildgröße ermöglicht und so deren Beurteilbarkeit in Hinblick auf signifikante medizinische Fragestellungen entscheidend verbessert. Die Ex-vivo-Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorgestellte Technik zukünftig auch in vivo vor allem zur Diagnose und Erforschung von Hautkrankheiten verwendet werden kann.